TURKISH JOURNAL OF ONCOLOGY

Summary

AMAÇ
Meme kanserinde kemik iliği mikrometastazı saptanmasında sitokeratin 19 (CK19) ve DF3 gen ekspresyonlarının araştırıldığı moleküler bir yöntemin etkinliğini değerlendirmektir.

GEREÇ VE YÖNTEM
Klinik olarak aksilla negatif olan 28 erken evre meme kanserli hastadan alınan kemik iliği aspiratlarında revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) tekniğiyle CK19 ve DF3 genlerine özgü iki ayrı primer kullanılarak mikrometastatik kanser hücresi araştırıldı.

BULGULAR
Hastaların ortanca yaşı 47,5'tir (32-86). RT-PCR çalışmalarında negatif kontrol olarak kullanılan kronik miyeloid lösemili kemik iliği örneklerinin keratin 19 ekspresyonun pozitif ve DF3 ekspresyonunun ise negatif bulunması üzerine, sonraki deneylerde DF3 primeri kullanı ldı. Yirmi sekiz hastanın 18'inde (%64) DF3 pozitif olarak saptandı. DF3 pozitifliği ile hastaların evresi, tümör büyüklüğü (< 2 cm ve > 2 cm), aksiller tutulum, ER/PR pozitifliği ve HG veya NG yüksekliği gibi parametreler arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark bulunamadı.

SONUÇ
Erken evre meme kanserli hastalarda kemik iliğinde RT-PCR ile DF3 gen ekspresyonunun varlığının araştırılması yoluyla mikrometastaz saptanması tekniğinin, spesifikliğinin ve duyarlılığının yüksek olması nedeniyle etkin bir yöntem olduğu düşünülmektedir.

Summary

Introduction

Günümüze dek yapılan pek çok geniş kapsamlı klinik çalışmada meme kanserinde kemik iliği mikrometastazlarının kötü prognostik faktör olduğu ortaya konmuştur.[1]-[5] Braun ve ark. tarafından yayınlanan 4703 hastayı kapsayan metaanalizde, operabl evre I/II/III meme kanserinde immünositokimyasal yöntemle saptanan kemik iliği metastazı oranı yaklaşık %31 olarak bildirilmiştir.[4] Bu hastalarda çok değişkenli analizde kemik iliği metastazları diğer faktörlerden bağımsız olarak genel ve meme kanseri spesifik sağkalım oranlarıyla da ters orantılı olarak bulunmuştur.[4]

Bu çalışmaların çoğunda kemik iliğinde mikrometastatik kanser hücreleri pansitokeratin antikorları kullanılarak immünositokimyasal yöntemlerle morfolojik olarak belirlenmiştir.[1]-[6] Bu teknikle 10⁵ kemik iliği hücresinde 1 kanser hücresi saptamak mümkündür.

İmmünositokimyasal yöntemlerin yanı sıra yeni ve daha hassas tekniklerle sitokeratin-19 (CK19) gibi sitokeratin primerleri kullanılarak revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RTPCR) ile 10⁶'da bir kanser hücresi veya çeşitli sitokeratin antikorları kullanılarak immünomagnetik zenginleştirme yöntemleriyle 10⁷-10⁸ mononüklear hücrede bir kanser hücresi saptamak mümkün olmuştur.[7]-[10] Ancak bu tekniklerin bir dezavantajı CK19 gibi sitokeratinlerin mononüklear hücrelerde de eksprese olmasından dolayı yalancı pozitifliklerin görülmesidir.[7],[11],[12]

Bu nedenle CK19 geni yerine çeşitli müsin genleri (MUC5B, MUC1, DF3) veya MAGE-A multimarker paneli gibi yalancı pozitiflik oranı düşük diğer meme kanseri antijenlerine özgü gen bölgelerinin kullanılması araştırılmaktadır.[13]-[18]

Bu çalışmadaki amacımız, erken evre meme kanserli hastalardan alınan kemik iliği örneklerinde rutin kullanılan CK19[19]-[29] ile daha az sıklıkla kullanılan DF3[21,30] gen ekspresyonlarının RTPCR tekniği ile araştırılarak bu tekniğin kanser hücrelerini saptamadaki teknik açıdan uygulanabilirliğini ve spesifisikliğini incelemektir. Ayrı ca bu teknikle saptanan kemik iliği mikrometastazları nın hasta ve tümör özellikleriyle ilişkisi de araştırılmıştır.

Introduction

Methods

İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı Meme Hastalıkları Tedavi ve Araştırma Merkezi’ne ardışık başvuran aksillası klinik olarak negatif 28 hasta çalışmaya alı ndı. Hastaları n uzak metastaz değerlendirilmesi için rutin biyokimya, akciğer grafisi, kemik sintigrafisi ve karaciğer ultrasonografisi tetkikleri istendi. Hastaların tümü, kemik iliği alınacağına dair ameliyat öncesi Helsinki Deklarasyonu Hasta Hakları Bildirgesine uygun olarak uygulanacak işlem hakkında bilgilendirildi ve yazılı izinleri alındı. Hastalardan genel anestezi altında ameliyat öncesi her iki spina iliaka anterior superior ve sternumdan (manibrium ve korpustan ayrı ayrı olmak üzere) Gallini kemik iliği aspirasyon iğnesi ( KM- 1,6 - 3,5) kullanılarak heparinize edilmiş enjektörlere toplam 10 cc kemik iliği materyali ile eş zamanlı olarak EDTA’lı tüplere 10’ar ml’lik periferik kan örneği alınd ı. Çalışmamızda pozitif kontrol olarak MCF-7 meme kanseri hücre soyu, negatif kontrol olarak ise kronik miyeloid lösemili (KML) 5 hastanın kemik iliği hücreleri kullanıldı.

Alınan kemik iliği örnekleri, %0,9’luk sodyum klorür solüsyonu ile 1:1 oranında sulandırıldıktan sonra kemik iliği mononükleer hücrelerinin Ficoll Histopaque yoğunluk gradienti yöntemi ile ayrılmasını takiben çalışmanın yapılacağı zamana dek nitrojen tankında -176 °C’de saklandı. Saklanan hücre pelletleri direkt olarak Trizol çözeltisi (GIBCO-BRL) ile muamele edilerek RNA izole edildi. RNA kalitesi %1,5’lik agarozda kontrol edildikten sonra, 1-5 μg RNA Revert Aid First Strand cDNA synthesis Kit (Fermentas, EU) kullanılarak cDNA’ye dönüştürüldü. CK19 gen ekspresyonunu belirlemek icin iki aşamalı, DF3 gen ekspresyonunu belirlemek için ise tek aşamalı PCR kullanıldı.

İlk olarak, hazırlanan cDNA’ların 1 μl’si birinci aşama PCR için CK19 genine özgü eksternal primerler (A ve B primer setleri CK19 External Forward: 5’- AAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGC-3’, CK19 External Reverse: 5’-TTATTGGCAGGTCAGGAGAAGAGCC-3’) varlığında amplifiye edildi. İkinci aşama PCR reaksiyonunda ise, birinci aşama PCR reaksiyonu sonucu oluşan PCR ürünleri (1 μl) internal primer çiftleriyle (CK19 Internal Forward: 5’-TCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC-3’, CK19 Internal Reverse: 5’ CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC-3’) amplifikasyona sokuldu.

DF3 gen ekspresyonunu belirlemek icin ise tek aşamalı PCR yapıldı (DF3 Forward: 5’- CACAGTGCTTACAGCTACCA-3’, DF3 Reverse: AGGTGGCAGCTGAACCTGAA- 3’). Her iki gen ve aşama için PCR işlemi 95 °C’de 30 saniye, 55 °C’de 30 saniye, 72 °C’de 1 dakikadan oluşan 30 çevrim sonunda 72 °C’de 10 dakikalık inkübasyonla tamamlandı. İkinci aşama PCR sonucunda PCR ürünleri (10 μl) %2’lik agaroz jelde yürütülerek, gen amplifikasyon varlığına bakılarak mikrometastaz varlığı değerlendirildi.

Tüm istatistiksel analizler SPSS 15.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL) programı kullanılarak yapıldı. Hasta ve tümör özellikleriyle DF3 pozitifliği arası ndaki korelasyonda çift yönlü Fisher testi kullanıldı, p<0,05 değeri istatistiksel açıdan anlamlı kabul edildi.

Methods

Results

Çalışmaya 13’ü evre I (%46,4) ve 15’i evre II (%53,6) olmak üzere 28 hasta alındı. Hastaların ortanca yaşı 47,5’tir (32-86). Hastaların demografik, klinik ve tümör özellikleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Tablo 1: Hastaların klinik ve tümör özellikleri

CK19 Gen Ekspresyonu
Meme kanserli 28 hasta ve kontrol olarak 5 KML hastasından elde edilen kemik iliği örnekleri CK19 ve DF3 (müsin benzeri) genlerine özgü primerleri kullanılarak RT-PCR tekniğiyle sözkonusu genlerin ekspresyonu araştırıldı. CK19 primerleri kullanılarak incelenen kemik iliği örneklerinin tümünde bu genin ekspresyonunun saptanmış olması nedeni ile yalancı pozitiflikten şüphelenildi ve örnekler ilk olarak 1:106 düzeyinde sulandırılarak tekrar incelendi. Ancak ikinci inceleme aşamasında da bir önceki ile aynı sonuçlar elde edildiğinden CK19 geninin bu çalışma için uygun olmadığı sonucuna varıldı. Bunun üzerine, ikinci primer seçimi olarak literatürde yalancı pozitiflik bildirilmeyen DF3 primerinin kullanılabileceği düşünüldü.

DF3 Gen Ekspresyonu
DF3 primerleri ile çalışmaya başlamadan önce primer seti öncelikle çalışmamızda negatif kontrol olarak kullanılan bütün KML kemik iliği ve normal kişilerin periferik kan örneklerinde ve pozitif kontrol olarak kullanılan MCF-7 meme kanseri hücre soyunda test edildi. Negatif kontrol olarak kullanılan örneklerde DF3 gen ekspresyonuna rastlanmazken, pozitif kontrol olarak kullanılan MCF-7 hücre soyunda DF3 gen ekspresyonu gözlendi (Şekil 1). DF3 gen primerlerinin çalışmamız için uygun olduğu saptandıktan sonra, çalışma hastalarına ait kemik iliği örneklerinde DF3 gen ekspresyonunun varlığı incelendi.

Sekil 1: DF3 genine özgü primerler kullanılarak elde edilen RT-PCR ürünlerinin elektroforetik görünümü (3 no’lu çıktı pozitif kontrol, 4 no’lu çıktı negatif kontrol, diğerleri hastalara ait olmak üzere 7 ve 13 no’lu çıktılar negatif ve geri kalanları pozitif bant olarak değerlendirilmiştir).

Çalışmamızda 28 hastanın 18’inde (%64) DF3 gen ekspresyonu saptandı (Şekil 1). On üç evre I meme kanserli hastanın 7’sinde (%54) ve 15 evre II hastanın 11’inde (%73) DF3 pozitifliği bulunurken, aksiller lenf nodu negatif 13 hastanın 8’inde (%62) ve lenf nodu tutulumu olan 15 hastanın ise 10’unda (%67) DF3 pozitifliği saptandı. DF3 geni ekspresyon varlığı ile hastaların evresi, tümör büyüklüğ ü (<2 cm ve >2 cm), aksiller tutulum, ER/PR pozitifliği, ve HG, NG gibi hasta ve tümör özellikleri arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark saptanmadı (Tablo 2). Tablo 2: Hastaların klinik ve tümör özelliklerine göre DF3 gen ekspresyonu dağılımı

Results

Discussion

Meme kanserinin evrelendirilmesinde tümör büyüklüğü ve aksiller lenf nodu tutulumu en önemli ve kuvvetli prognostik faktörlerdir.[31] AJCC 2002 meme kanseri evreleme sınıflandırması nda sentinel lenf nodlarının değerlendirmesinde sitokeratin antikorlarıyla immünohistokimyasal tekniklerin yanısıra RT- PCR ile moleküler yöntemlerle mikrometastaz saptanması gündeme gelmiştir.[31] İmmünositokimyasal yöntemlerle saptanan kemik iliği mikrometastazlarının varlığının da özellikle erken evre meme kanserli hastalarda ek kötü bir prognostik faktör olduğu bilinmektedir.[1]-[4] Günümüzde kemik iliğinde mikrometastaz tayininde sitokeratin antikorları kullanılarak yapılan immünositokimyasal yöntemlerin yanı sıra, RT-PCR veya immünomagnetik zenginleştirme tekniği ile kombine edilen RT-PCR/immünositokimya/ flow-sitometri gibi çok daha duyarlı yöntemler kullanılmaktadır.[7]-[10],[23] Metastatik hücrelerin RT-PCR yöntemiyle 1/5x105-107 arasında bir hassasiyetle gösterilebileceği bilinmektedir.[30] Ancak sözkonusu yöntemlerdeki aşılması gereken en büyük sorun yalancı pozitifliktir. Biz bu çalışmamızda meme kanserli hastalarda kemik iliği mikrometastazlarının saptanmasında RT-PCR yöntemi kullanılarak CK19 ve müsin benzeri DF3 gen ekspresyonlarının uygulanabilirliğini ve hastaların diğer prognostik faktörleriyle ilişkisini araştırdık.

RT-PCR çalışmalarında en çok sitokeratin antijenlerine ait primerler kullanılmaktadır. Periferik kan ve kemik iliğinde dolaşan meme kanseri hücrelerinin saptanmasında sıklıkla kullanılan sitokeratin gen (CK2, CK8, K18, CK19, CK20) ekspresyonları incelenmektedir. Ancak sitokeratin genleri mononükleer hücreler, endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi hematolojik hücreler tarafından da ekspresse edilmektedir. Bu nedenle CK19 epitelyal kaynaklı tümör hücrelerini saptamada en sık kullanılan birkaç belirteçten biri olmasına rağmen yalancı pozitiflik verebilmektedir.[32] Çalışmamızda literatürdeki mevcut bilgilere paralel olarak bizim hasta ve kontrol grubumuzda da CK19 gen ekspresyonunun yalancı pozitif sonuçlar verdiği saptanmıştır.[11],[12],[28] Bu yalancı pozitifliğin olası nedenleri, metodolojik kontaminasyon, kemik iliğinin alınması esnasında ciltten epitelyal hücre kontaminasyonu ve periferik kök hücrelerde normalde önemsenmeyecek kadar az miktardaki CK19 ekspresyonunun metodun hassasiyeti nedeniyle saptanması olabileceği düşünüldü. CK19 ile yalancı pozitiflik elde etmiş çalışmalara dayanarak,[11],[12],[28] bu yayınlarda önerildiği gibi lizat örneklerindeki muhtemel bir kontaminasyonu ortadan kaldırmak için benzer şekilde dilüsyon çalışmaları da denendi. Literatürde bildirilen[11] 1/5 cDNA dilüsyonunun yanısıra 1/10⁶’ya kadar seri titrasyonlar yapmamıza rağmen kontrol örneklerde yalancı pozitifliğin sebat ettiği saptanınca laboratuvarımız ve bu yöntem şartlarında CK19 primeri ile çalışılmamasına karar verildi.

Datta ve ark.ları tarafından yapılan çalışmada RT-PCR yöntemiyle CK-19 ekspresyonu araştırılarak yüksek doz kemoterapiyle birlikte otolog kemik iliği nakli uygulanmış meme kanseri hastalarının kemik ilikleri sitoferez yöntemiyle alınarak meme kanseri hücresi aranmıştır.[33] Bu çalışmada normal periferik kan örneklerinde ve kemik iliğinde CK19 ekspresyonu tespit edilmemiş olmasına karşın, bu konuda daha sonra yapılan başka bir yayında aynı yöntem kullanılmasına karşın yüksek yalancı pozitiflik saptanmıştır.[34] CK19-RT-PCR yöntemindeki yalancı pozitifliklerin CK19 psödogeninden de kaynaklanabileceği ve bunun kontaminasyonunu elimine etmek için RTPCR yönteminde buna yönelik modifikasyonlar yapmak gerektiği de bildirilmiştir.[35] Günümüzde CK19 gen ekspresyonu daha çok real- time RTPCR yöntemiyle kantitatif olarak bakılmakta ve bu yöntem şartlarında yöntemin spesifikliğinin güvenilir olduğu bildirilmektedir.[22],[24],[25],[28]

Çalışmamızda CK19 primeri kullanılarak yüksek yalancı pozitiflik saptanması üzerine, literatürde henüz yalancı pozitiflik bildirilmeyen müsin benzeri glikoprotein grubunda yer alan DF3 antijenine ait DF3 primerinin kullanılması düşünüldü.[30] Negatif kontrol örneklerde yaptığımız ön çalışmada da yalancı pozitiflik saptanmaması üzerine PCR grubundaki tüm hastalarda kemik iliği örneklerinin değerlendirilmesinde DF3 primeri kullanıldı. DF3’ün yalancı pozitiflik oranının bulunmaması gelecekte RT-PCR çalışmalarında sık kullanı lan sitokeratin primerlerine iyi bir alternatif olabileceğini düşündürmektedir.

Sonuç olarak, evre I ve evre II toplam 28 hastadan 18’inde (%64) DF3 pozitifliği saptandı. Kemik iliğinde RT-PCR yöntemiyle saptanan mikrometastaz çalışmalarında diğer çalışmalarda da benzer olarak operabl meme kanserinde %32-61 arasında değişen pozitiflik oranları bildirilmiştir.[23]-[25],[27],[36] Bu değerler immünositokimyasal yöntemlerle %29-36 civarında saptanan kemik iliği tutulum yüzdelerinden çok daha yüksektir.[1]-[4] RTPCR gibi çok duyarlı yöntemlerle saptanan kemik iliği pozitifliklerinin prognostik önemi konusunda az sayıda çalışmada kötü prognostik faktör olduğu ve hastalıksız ve genel sağkalımı olumsuz etkilediği bildirilmiştir.[5],[37] Ancak bu konuda öncelikle kullanılan RT-PCR yöntemlerinin standardizasyonuna ve daha geniş kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır.

Benoy ve ark.nın[25] operabl meme kanserli hastalarda kantitatif RT-PCR yöntemiyle kemik iliği metastazlarını değerlendirmek üzere yaptıkları bir çalışmada, CK19 gen ekspresyonu ile sadece tümör vaskülerizasyonu arasında bir korelasyon bulunmuş, diğer tümör özellikleri ile bir ilişki saptanmamıştır. Çalışmamızda da literatürdekine benzer olarak DF3 ekspresyonu pozitif kemik iliği ile evre, tümör büyüklüğü, aksiller lenf nodu tutulumu ve yüksek tümör gradı gibi faktörler arası nda bir ilişkisi bulunamamıştır.

Sonuç olarak, RT-PCR yöntemiyle DF3 gen ekspresyonu saptanarak kemik iliği mikrometastazlarının belirlenmesinin spesifik ve duyarlı bir yöntem olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle RTPCR yöntemi ile DF3 gen ekspresyonunun tek başı na veya diğer ilave gen ekspresyonları ile kombine edilerek gösterilmesi ile kemik iliği pozitiflikleri saptanabilir. Bu hassas yöntemlerle saptanan kemik iliği pozitifliklerinin prognostik önemi ise ileride yapılacak geniş çalışmalarla belirlenecektir.

Teşekkür
Bu proje, 873/090896 sayılı ve “Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Magnetik Rezonans Görüntüleme Teknikleriyle Erken Evre Meme Kanserinde Kemik İliği Metastazlarının Araştırılması“ başlı klı proje nedeniyle İ.Ü. Araştırma Fonunca desteklenmiştir.

Discussion