TURKISH JOURNAL OF ONCOLOGY

Summary

AMAÇ
Bu çalışmada, seröz efüzyonlarda malign mezotelyoma, reaktif mezotelyal proliferasyon ve adenokarsinom ayırımında E-kaderin, Kalretinin ve GLUT-1 antikorlarının immünsitokimyasal yöntemle ekspresyonu araştırıldı.

GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışma grubunu herbir gruptan 20, toplamda 60 hastadan elde edilen hücre bloğu materyali oluşturdu. Seçilen uygun olgulardan elde edilen hücre bloğu materyalinden hazırlanan kesitlere immünsitokimyasal boyama yöntemi uygulandı.

BULGULAR
Çalışmamızda elde edilen bulgulara göre, E-kaderin antikorunun adenokarsinomda, Kalretinin antikorunun mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonunda, GLUT-1 antikorunun ise mezotelyoma ve adenokarsinomda güçlü ekspresyonu saptandı.

SONUÇ
Bulgular sonucunda E-kaderin antikorunun adenokarsinomun mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonundan ayrılmasında; Kalretinin antikorunun mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonunun adenokarsinomdan ayrılmasında; GLUT-1 antikorunun ise adenokarsinom ve mezotelyomanın reaktif mezotel hücre proliferasyonundan ayrılmasında kullanılabilecek markerlar olduğu gösterilmiştir.

Summary

Introduction

Malign mezotelyoma plevra, periton ve perikard gibi seröz yüzeylerden çıkan bir tümördür ve asbest maruziyetiyle yakından ilişkilidir.[1,2] Bu tümör tunica vaginalis’te de tarif edilmiştir.[2] Malign mezotelyoma dünya çapında artış göstermektedir. [3] Oldukça ölümcül bir kanser türüdür. Medikal ve cerrahi tedavideki son gelişmeler sağkalımda ilerlemeler sağlasa da tedavi oldukça toksik kalmaktadır ve bu tedaviler için uygun hasta seçimi zordur. [4] Malign mezotelyomanın sitomorfolojik özelliklerinden dolayı reaktif mezotelyal proliferasyon ve metastatik karsinomdan ayırımı zordur.[2,5,6] İmmünsitokimya bu ayırımın yapılmasında oldukça fayda sağlamaktadır.[7]

Çalışmamızın amacı, seröz efüzyonlarda malign mezotelyoma, reaktif mezotel hücre proliferasyonu ve adenokarsinom arasındaki sitopatolojik ayırımda E-kaderin, Kalretinin ve GLUT-1 antikorlarının immünsitokimyasal yöntemle ekspresyonunun araştırılmasıdır.

Introduction

Methods

Çalışmamızda İstanbul Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü Onkolojik Sitoloji Bilim Dalı arşivi, İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Bilim Dalı arşivi, Yedikule Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji Laboratuarı arşivinde 1995-2008 yılları arasında seröz efüzyonlarda reaktif mezotel hücre proliferasyonu, malign mezotelyoma ve adenokarsinom tanısı konmuş olgulardan, her bir gruptan 20 adet, toplamda 60 hastadan elde edilen hücre bloğu materyali kullanıldı. Çalışma grubunu oluşturan malign mezotelyoma tanısı almış 20 hücre bloğu materyalinin 20’si de plevra sıvısıydı. Sitopatolojik olarak sınıflandırıldığında, malign mezotelyoma olgularının 19’u epiteloid tipte, 1’i bifazik tipteydi. Reaktif mezotel hücre proliferasyonu tanısı almış 20 hücre bloğu materyalinin 15’i plevra sıvısı, 5’i periton sıvısıydı. Adenokarsinom tanısı almış 20 hücre bloğu materyalinin 7’si plevra sıvısı, 12’si periton sıvısı, 1’i perikard sıvısıydı.

Seçilen uygun vakalardan elde edilen hücre bloğu materyalinden hazırlanan kesitlere immünsitokimyasal boyama yöntemi uygulandı. Rutin formol-parafin takibinden geçen hücre bloğu materyalinin parafin bloklarından pozitif şarjlı lamlara yaklaşık 5 mikron kalınlığında kesitler alındı. Kesitlerin lam üzerine tam olarak yapışmaları ve deparafinizasyonu için lamlar bir gece boyunca 56ºC sıcaklıkta etüvde bekletildi. Boyama işlemine başlamadan önce lamlar sırasıyla ksilol’de 30 dakika, 99º’lik alkolde 15 dakika, 96º’lik alkolde 15 dakika bekletilerek distile suya alındı. Daha sonra kesitlere sırasıyla aşağıdaki işlemler uygulandı.

1. Formalin fiksasyonuyla oluşan gizlenmiş antijenik bölgelerin açığa çıkarılması amacıyla Antijen Retrieval Reagent solüsyonları ile ön muamele yapıldı. Bu amaçla Kalretinin antikoru için EDTA buffer, E-kaderin ve GLUT-1 antikorları için Citrate Buffer solüsyonu kullanıldı. Antijen retrieval işlemi mikrodalga fırında 5 dakikadan 4 kez uygulandı ve daha sonra 20 dakika oda ısısında soğumaya bırakıldı. Soğuyan lamlar distile suya alındı, kesitlerin etrafı pappen kalemi ile çizilerek 5 dakika Fosfat Buffer Solüsyonu’nda (PBS) bekletildi.

2. Endojen peroksidaz aktivitesinin önlenmesi için kesitler %3’lük hidrojen peroksitle inkübe edildi. Süre sonunda lamlar distile su ile yıkandı; 5 dakika PBS’te bekletildi.

3. Non-spesifik zemin boyanmasını önlemek için kesitler 15 dakika blokaj solüsyonu (Preblocking solution, Life Science Division, 110 ml.) ile inkübe edildi. Süre sonunda lamlar distile su ile yıkanmadan, silkelenerek bir sonraki aşamaya geçildi.

4. Primer antikorlar damlatıldı. Kalretinin antikoru (Zymed, Mouse, Monoklonal, Clone Z11-E3) için 120 dakika, E-kaderin antikoru (Invitrogen, Mouse, Monoklonal, Clone 4A2C7) için 120 dakika ve GLUT-1 antikoru (Abcam, Mouse, Monoklonal, Clone SPM498) için gece inkübasyonu uygulandı. Süre sonunda lamlar distile su ile yıkandı; 5 dakika PBS’te bekletildi.

5. Sekonder antikor solüsyonu (Second Antibody, Life Science Division, 110 ml.) damlatıldı ve 25 dakika inkübe edildi. Süre sonunda lamlar distile su ile yıkandı; 5 dakika PBS’te bekletildi.

6. Peroksidaz-streptavidin (Peroxidase - streptavidin, Life Science Division, 110 ml.) damlatıldı; 25 dakika inkübe edildi. Süre sonunda lamlar distile su ile yıkandı; 5 dakika PBS’te bekletildi.

7. Kesitler AEC kromojen (AEC substrate buffer (x20), AEC kromogen (x20), hydrogen peroxide (x20)) ile 20 dakika inkübe edildi. Süre sonunda lamlar distile su ile yıkandı.

8. Lamlar 3 dakika Mayer Hematoksilen’de bekletildikten sonra musluk suyu ile yıkandı. Daha sonra 15 saniye amonyaklı suda bekletilerek distile suya alındı. Tüm preparatlar su bazlı kapatma malzemesiyle kapatılarak ışık mikroskobunda incelendi.

E-kaderin, Kalretinin ve GLUT-1 ile boyanan preparatlarda tüm tümör hücrelerinden;

%0-10 arasında boyanma gösterenler negatif (-),
%11-30 arasında boyanma gösterenler 1 pozitif (+),
%31-60 arasında boyanma gösterenler 2 pozitif (++),
%61-100 arasında boyanma gösterenler 3 pozitif (+++) olarak değerlendirildi.

Hasta gruplarının dağılımı E-kaderin, Kalretinin ve GLUT-1 antikorlarının boyanma dereceleri ki-kare testleri ile karşılaştırıldı. Anlamlılık sınırı p<0.05 kabul edildi. Hesaplamalar Graph Pad Instat Version 2.02 programı ile yapıldı. Gruplar arasındaki yaş dağılımı karşılaştırılması Anova testi ile yapıldı.

Methods

Results

Cinsiyet grupları arasında yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda (malign mezotelyoma erkek: 11, kadın: 9; reaktif mezotel hücre proliferasyonu erkek: 13, kadın: 7; adenokarsinom erkek: 8, kadın: 12) anlamlı bir farklılık tespit edilememiştir (p=0.28).

Malign mezotelyoma olgularında yaş aralığı 36- 78, medyan değeri 55, standart sapma ±12.25, ortalama 55.45; reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularında yaş aralığı 11-87, medyan değeri 58.5, standart sapma ±16.16, ortalama 56.95; adenokarsinom olgularında yaş aralığı 41-82, medyan değeri 60, standart sapma ±10.33, ortalama 60.41 bulunmuştur. Üç grup arasında yaş dağılımları arasında yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda anlamlı bir farklılık tespit edilememiştir (p=0.52).

Çalışmamızda E-kaderin ve GLUT-1 membranöz boyanma (Şekil 1, 2, 3), Kalretinin sitoplazmik ve nükleer boyanma (Şekil 4, 5) göstermiştir.

Sekil 1: Adenokarsinom hücrelerinde E-kaderin pozitifliği (x200).

Sekil 2: Adenokarsinom hücrelerinde GLUT-1 pozitifliği (x400).

Sekil 3: Malign mezotelyoma hücrelerinde GLUT-1 pozitifliği (x200).

Sekil 4: Malign mezotelyoma hücrelerinde kalretinin pozitifliği (x400).

Sekil 5: Reaktif mezotel hücrelerinde kalretinin pozitifliği (x400).

Olguların tanı gruplarına göre immünsitokimyasal boyanma derecelerinin istatistiksel incelenmesinin yapılabilmesi için boyanma dereceleri iki grupta toplanmıştır. Buna göre negatif (-) ve 1 pozitif(+) boyanan olgular negatif (-) grubunu, 2 pozitif (++) ve 3 pozitif (+++) boyanan olgular pozitif (+) grubunu oluşturmuştur.

E-kaderin antikoru ile malign mezotelyoma olgularının 19’u negatif (-), 1’i pozitif (+); reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularının 19’u negatif (-), 1’i pozitif (+); adenokarsinom olgularının 1’i negatif (-), 19’u pozitif (+) boyanma göstermiştir. E-kaderin ekspresyonunun tanı gruplarına göre yapılan istatistiksel incelemesinde, bu antikorun malign mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularına oranla adenokarsinom olgularında anlamlı derecede fazla boyanma gösterdiği saptanmıştır (p<0.001).

Kalretinin antikoru ile malign mezotelyoma olgularının 20’si pozitif (+), reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularının 9’u negatif (-) 11’i pozitif (+); adenokarsinom olgularının 19’u negatif (-), 1’i pozitif (+) boyanma göstermiştir. Kalretinin ekspresyonunun tanı gruplarına göre yapılan istatistiksel incelemesinde bu antikorun adenokarsinom olgularına oranla, malign mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularında anlamlı derecede fazla boyandığı saptanmıştır (p<0.001).

GLUT-1 antikoru ile malign mezotelyoma olgularının 2’si negatif (-), 18’i pozitif (+); reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularının 19’u negatif (-), 1’i pozitif (+); adenokarsinom olgularının 1’i negatif (-), 19’u pozitif (+) boyanma göstermiştir. GLUT-1 ekspresyonunun tanı gruplarına göre yapılan istatistiksel incelemsinde, bu antikorun reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularına oranla, malign mezotelyoma ve adenokarsinom olgularında anlamlı derecede fazla boyanma gösterdiği saptanmıştır (p<0.001).

Results

Discussion

Efüzyon örneklerinde sitomorfolojik özelliklerinden dolayı malign mezotelyoma, metastatik adenokarsinom ve reaktif mezotel hücre proliferasyonu hücrelerinin ayırımının zor olması sitolojinin temel sorunlarından biridir.

Wang ve ark.[8] 1979 yılında epiteloid plevral mezotelyoma ve pulmoner adenokarsinom arasındaki ayırımda ilk kez immünhistokimyasal boyama yöntemini kullanmışlardır.

Kalretinin EF-el yapısına sahip 29 kDa kalsiyum bağımlı bir proteindir. S-100 proteini de EF-el yapısına sahip protein ailesi içinde yer almaktadır. [9,10] Periferal ve santral sinir dokularında eksprese olmasının yanı sıra mezotelyal hücrelerde de ekspresyonu vardır.[11] Bazı çalışmalarda Kalretinin’in mezotelyoma için pozitif bir marker olduğu gösterilmiştir.[12-14]

Doglioni ve ark.nın[13] yaptıkları çalışmada 44 mezotelyoma olgusunun 44’ünde (%100) Kalretinin pozitifliği saptanırken, 294 adenokarsinom olgusunun ise sadece 28’inde (%9.5) fokal boyanma gözlenmiştir.

King ve ark.nın[15] çalışmasında Kalretinin sensitivitesi 885 epiteloid mezotelyomalı doku örneğinde %82, 912 pulmoner adenokarsinom olgusunda ise %15 bulunmuştur. Diğer benzer çalışmalarda da mezotelyoma ve reaktif mezotel hücreleri için Kalretinin pozitifliği %92-100 arasında bulunmuştur.[7,16,17]

GLUT-1 glukoz transport ailesinin bir üyesidir ve hücre içine glikoz girişini kolaylaştırır. Yapılan immünhistokimyasal çalışmalarda GLUT-1 normal epitel dokusunda ve benign epitelyal tümörlerde tespit edilememiştir fakat çeşitli tümörlerde eksprese olmaktadır. GLUT-1 ekspresyonu malign lezyonlardan benign lezyonların ayrılmasında kullanılabilecek bir marker olarak gösterilmektedir.[18]

Kato ve ark.nın[18,19] çalışmalarında GLUT-1 pozitifliği plevral mezotelyoma olgularında %100 ve akciğer adenokarsinomu olgularında %95.2-%96.5 arasında bulunmuştur. Reaktif mezotel hücre proliferasyonu olgularının hiçbirinde GLUT-1 ile pozitiflik tespit edilememiştir.

Kaderinler hücre-hücre bağlantısını sağlamada önemli bir rol oynamaktadır. E-kaderin kalsiyum bağımlı epitel hücrelerinde eksprese intersellüler adezyon molekülüdür.[11]

Peralta ve ark.[20] yaptıkları çalışmada pulmoner adenokarsinomdan epiteloid mezotelyomanın ayrılmasında E-kaderinin kullanılabilecek bir marker olduğunu keşfetmişlerdir. Bu çalışmada 16 akciğer adenokarsinom olgusunun 16’sında (%100) boyanma saptanırken, 19 mezotelyoma olgusunun 8’inde (%42) birkaç tümör hücresinde pozitiflik gözlenmiştir. Su ve ark.nın[21] çalışmasında E-kaderin sensitivitesi %86.7, spesifitesi %98.1 bulunmuştur.

Sonuç olarak, Kalretinin antikorunun mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonunda, E-kaderin antikorunun adenokarsinomda, GLUT- 1’in mezotelyoma ve adenokarsinomda anlamlı derecede ekspresyonu gösterilmiştir. Bu bulgular sonucunda Kalretinin antikorunun malign mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonundan adenokarsinomun ayırımında; E-kaderin antikorunun adenokarsinomdan, malign mezotelyoma ve reaktif mezotel hücre proliferasyonunun ayırımında, GLUT-1 antikorunun ise reaktif mezotel hücre proliferasyonundan adenokarsinom ve malign mezotelyomanın ayırımında kullanılabilecek bir marker olduğu gösterilmiştir.

Discussion